睾丸活检术的步骤 睾丸活检检查的详细过程

2018-09-19 - 睾丸活检

苦味酸 2,4,6-三硝基苯酚,黄色晶体,易燃易爆,应制成饱和溶液贮藏。 能沉淀蛋白,也有软化组织的作用,还具有一定的脱钙作用,固定后的组织必须流水冲洗4小时以上才能脱水。一般与其它液体配合使用,如Bouin液:苦味酸85 ml,甲醛10 ml,冰醋酸5 ml。

重铬酸钾 K2Cr2O7 ,桔红色结晶,5%水溶液作固定用。可使蛋白质变为不溶性,不能沉淀蛋白质。但在溶液中加入醋酸后,也能使蛋白质沉淀。

用未酸化的重铬酸钾固定,可保持与生活状态相仿,对线粒体、高尔基氏体的固定很好,而且其穿透力极强,组织收缩亦小。缺点是溶解染色质。固定后的组织必须流水冲洗12小时以上。 醋酸 CH3COOH 5%水溶液作固定用。不能沉淀白蛋白,但能沉淀核蛋白。渗透性强,固定快,能使组织膨胀。常与其它液体配合使用。

观点: 1、笔者认为,10%甲醛液由于受到甲醛的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响,浓度被降低致组织固定不足,而高浓度的甲醛,降低了对组织的穿透性,形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践,本人认为以12~15%的甲醛最佳。

大标本(2cm厚)一般需要6~12个小时,小标本一般需要3~6个小时;当室温低18℃时,可在37℃以下的温箱内加温4~6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5~4.5, 中性甲醛对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。

骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳,经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液;少数单位还可建立组织冷冻库,以便适应各种特殊的处理要求。

2、经Bouin液固定的骨组织,如果脱钙不佳,还可再用10%硝酸脱钙,效果也不错。 3、有学者认为:“发灰”的主要原因是经中性甲醛固定后组织PH值呈弱碱性,不利于苏木素染液的结合。

如能在染苏木素前调整组织切片的HP至酸性可改善染色效果。在脱蜡水化后把切片浸入3%的乙酸溶液内(PH值3.0)处理5分钟,流水冲洗5分钟,常规苏木素染色。

用酸处理后可明显改善染色“发灰”现象,提高红蓝反差。但也有学者认为用酸处理后效果不明显。 4、甲醛可用作溶剂、防腐剂、还原剂。现代科学研究表明,甲醛对人体健康有负面影响。当室内含量为0.1毫克/立方米时就有异味和不适感;0.

5毫克/立方米时可刺激眼睛引起流泪;0.6毫克/立方米时引起咽喉不适或疼痛;浓度再高可引起恶心、呕吐、咳嗽、胸闷、气喘甚至肺气肿;当空气中达到230毫克/立方米时可当即导致死亡。

长期接触低剂量甲醛可以引起慢性呼吸道疾病、女性月经紊乱、妊娠综合症,引起新生儿体质降低、染色体异常,甚至引起鼻咽癌。高浓度的甲醛对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。它还可刺激眼结膜、呼吸道黏膜而产生流泪、流涕,引起结膜炎、咽喉炎、哮喘、支气管炎和变态反应性疾病。

甲醛还有致畸、致癌作用。据流行病学调查,长期接触甲醛的人,可引起鼻腔、口腔、鼻咽、咽喉、皮肤和消化道的癌症。保持室内空气的流通和良好的换气,是病理科必不可少的条件。

笔者认为,修建取材台时,抽气口做在台子下方,更利于甲醛气体的排出。 混合固定液 1、 Altmann液:用于固定线粒体,脂肪。固定时间约12-24h。 固定液配方:5%重铬酸钾水溶液10ml,2%锇酸水溶液10ml。

2、B-5固定液(醋酸钠-升汞-甲醛固定液):多用于固定淋巴组织。在染色前,应进行脱汞处理。 固定液配方:无水醋酸钠1.25g,升汞6g,甲醛10ml(用时加入),蒸镀馏水90ml。

3、B-4固定液:无水醋酸钠1.25g,升汞6g,蒸镀馏水100ml。在染色前,应进行脱汞处理。 4、Bouin液:是外科活检标本特别是骨髓、睾丸等组织固定的良好固定液。

适用于结缔组织染色,尤其是三色染色时更为理想,组织细胞结构完整,细胞核着色鲜明,但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好,尤其适用于含脂肪的淋巴结,乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸,pH为3-3.

5,对抗原有一定损害,使组织收缩,不适宜于标本的长期保存。固定时间12-24h。固定后组织被染成黄色,需要70%-80%酒精洗涤或流水冲洗。 固定液配方:饱和苦味酸水溶液:甲醛水溶液:冰醋酸=75:25:5。

5、 Carnoy液:固定胞浆和细胞核,对于染色体固定佳,显示DNA和RNA效果好。此液固定速度快,3mm厚的组织块1h固定左右,大块材料最好不要超过4h。 固定液配方:冰醋酸10ml,氯仿30ml,无水酒精60ml。

6、 Champy液  主要用于固定线粒体和高尔基复合体。该固定液穿透能力差,组织块应小。固定时间6-24h,固定后流水冲洗过液。

固定液配方:3%重铬酸钾70ml,1%铬酸70ml,2%锇酸40ml。 7、 Helly液  该液也称为Zenker福尔马林液。该固定液对细胞质固定较好,对某些细胞质内特殊颗粒、胰岛和垂体前叶各种细胞的显示及心肌闰盘保存有良好的效果。

固定液配方:重铬酸钾2.5g,升汞5g,蒸馏水100ml,甲醛5ml。 在染色前,应进行脱汞处理。 8、 Kanovsky液:适用于免疫电镜标本的前固定,对细胞抗原性和细胞微细结构的保存较戊二醛好。

固定时一般先灌注,而后再浸泡固定10-30min,用缓冲液漂洗后,用蔗糖液浸泡后恒温冷冻切片。 固定液配方:25%戊二醛10ml,40%甲醛5ml,0.

2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml,无水氯化钙50mg,蒸馏水33.5ml,蒸馏水最后加入,pH约7.3。 9、 Kolmer液:用于眼球和神经组织的固定。固定时间24h左右。

固定液配方:5%重铬酸钾水溶液4份,10%甲醛4份,冰醋酸1份,三氯醋酸水溶液1份,10%醋酸钠水溶液1份。 10、 Metchcarn液:适用于某些癌基因蛋白产物和一些抗原的固定,固定时间:室温4-24h。

固定液配方:甲醇60ml,氯仿10ml,.醋酸10ml。 11、Romeis液:可作为一般固定液应用,也可用于其他固定液固定后的再固定。有利于Heidehain铁苏木精染色,有后媒染作用。

固定液配方:升汞饱和水溶液50ml,5%三氯醋酸水溶液40ml,甲醛10ml(临用时加入)。固定时间12-24h ,固定后入95%酒精脱水。 12、Rossman液:对糖原固定较好。

固定12-24h后,固定后用95%酒精洗。纯酒精脱水。 固定液配方:无水乙醇苦味酸饱和液90ml,甲醛10ml。 13、Verhoeff液  用于固定眼球,固定48h后,即可脱水。 固定液配方:甲醛水溶液10ml,95%酒精48ml,蒸馏水36ml,苦味酸1g。

14、Zenker液:为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织,使细胞核和细胞质染色较清晰,常用于三色染色。对免疫球蛋白染色最好、病毒包涵体(如Negri小体)的固定效果较好。

进行磷钨酸-苏木精染色的组织也应该使用该固定液。但对于含血量较多的标本不合适。固定时间12-36h,加热可加快固定作用。 固定液配方:储存液由重铬酸钾2.

5g,升汞5g,蒸馏水100ml 组成,用时加入冰醋酸5ml。配制该液体时,可将重铬酸钾和升汞一起加入蒸馏水中,加温40-50℃溶解,冷却过滤后存于棕色瓶内。同时取此液95ml,加冰醋酸5ml即可。

此固定液不能用金属容器盛放,组织固定后,也不能用金属镊夹取。如果此液中的冰醋酸用甲醛代替即为Helly液。在Zenker储存液中加入10ml甲醛水溶液,为Maximow液。 固定后流水冲洗12h去除重铬酸钾,或用亚硫酸钠溶液冲洗,也可用1%的氨水溶液洗涤。

在70%酒精脱水时加入碘(配成0.5%碘酒)脱汞。 15、4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3):该固定液适用于免疫组织化学方法。

动物先用此液进行灌注固定,取材后,再用该液浸泡固定2-24h。 固定液配方:40g多聚甲醛,溶于1000ml,0.1mol/L的PB液,不容易溶解,放于密封瓶中,60℃温箱过夜即可溶解,也可以加温至60℃,搅拌溶解。

16、4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液:该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。用于免疫电镜标本时,应加入新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5-1%。此固定液性质温和,可长期保存组织。

固定液配方:甲液-多聚甲醛40g,蒸馏水400ml;乙液-NaH2PO4•2H2O16.88g,蒸馏水300ml;丙液-NaOH3.86g,蒸馏水200ml。先将甲液中多聚甲完全溶解,乙液倒入丙液混合后倒入甲液,用1mol/LNaOH或1mol/L HCL将pH调至7.

2-7.4。补充蒸馏水至1000ml,充分混合后,4℃保存。 17、中性缓冲甲醛液:对大多数抗原保存较好,是免疫组织化学最常用的固定液,组织穿透性好,组织收缩小。

固定时间以24h以内为宜。 固定液配方1:40%甲醛10ml,0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。 固定液配方2:40%甲醛120ml,蒸馏水880ml,磷酸二氢钠(NaH2PO4•H2O)4g,磷酸氢二钠(Na2HPO4)13g。

脱蜡也相当重要,如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀,所以,脱蜡用的二甲苯要经常更换,一般用3道二甲苯,每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时,必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡,或将二甲苯放入温箱内预热(37℃左右)脱蜡,最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯,至水。

二、生物染料 染料从来源上可分为天然染料(如苏木精、卡红、巴西木精)和人工合成染料;从化学组成上可分为无机染料和有机染料。我们常用的染料主要是人工合成的煤焦油染料,它主要是含主香碳环和杂环的有机化合物。

这些有机化合物必须自身具有颜色,同时与被染物质分子间有一定的亲和力方能称为染料。我们知道,染料的颜色和与被染物分子间的亲和力是由染料的分子结构决定的。在染料分子中有使其产生颜色的发色团和使染料颜色加深的并与被染物质间产生亲和力的助色团。

(一)发色团 使有机分子产生颜色的含有不饱和键的基团称为发色团也称生色团。将发色团引入分子之后可使有机化合物选择性吸收光谱向长波长移动,即从肉眼不可见的紫外光区移向可见光区,从而使分子显色。

有机分子中引入发色团有可能使有机化合物显色,但在有机分子中仅仅有发色团并不一定就显示颜色,还要看发色团被引入有机分子后,是否使有机分子形成较大的共轭体系,共轭程度越大颜色越深。

有颜色的有机分子必需引入助色团,才能与被染物分子产生亲和力,使被染物着色,因此把有发色团又有助色团的有机化合物称为染料。 (二)助色团 能够使染料分子颜色加深,极性加大,并与被染物质分子间形成亲和力的基团称为助色团。

使染料分子与被染物质分子间产生亲和力是助色团最主要的作用。助色团使染料分子色度加深、染料分子极性增强,易离子化。 助色团多为极性基因,有的还具有酸碱性,如—OH与苯环相连有弱酸性,—NH2及其取代物具有碱性,—SO3H具有强酸性,—COOH具有弱酸性,这些基因引入有机分子之后不仅增强其极性而且与碱或酸成盐,易溶于水并电离成正负离子,促进染料与被染物分子间的结合。

三、染料的分类 1、天然染料 2、合成染料(又称煤焦油染料) 合成染料都是从煤焦油中提取苯的衍生物。它还可以按其分子中所含的发色团现分为九大类(或十大类)。 (1)亚硝基染料类 发色团为亚硝基(—NO),如萘酚绿—B (2)硝基染料类 发色团为硝基(—NO2),如苦味酸,萘酚黄—S,马汀黄。

(3)偶氮染料 发色团为偶氮基(—N=N—)。这一类染色剂很多。常用的有偶氮红,刚果红,偶氮焰红,丽春红,俾士麦棕,橙黄-G,苏丹I-Ⅳ,苏丹黑-B,油红-O等。

(4)重氮盐类 (5)醌亚胺染料 这类染料分子中含有两个发色团,一个是亚胺基及一个醌基常用的有:中性红,美蓝,,尼罗蓝、天青石蓝甲苯胺蓝,硫堇、亚甲绿、萘酚蓝、沙黄、亚甲紫、天青、焦油紫等。

(6)苯甲烷类染料 发色团为醌基,分子结构中一个碳原子上连有两个苯基和一个醌基。 常用的有:碱性品红,酸性品红,苯胺兰,二甲苯蓝,依思明蓝,亮绿,碘绿,黄色浅绿—SF,孔雀绿,甲基绿,结晶紫、霍夫曼紫、乙基紫,尤胆紫(无水结晶)、甲基紫等,如:孔雀绿的结构。

(7) 叮类染料 发色团为醌基。 (8)蒽醌染料 发色团为醌基。 (9)噻唑类染料 发色团为胺基,偶氮基等。

(10)喹啉类染料 发色团为醌型结构喹啉环。常用的喹啉类染料为花青素(喹啉蓝)。 3、无机化合物 除了天然染色剂和合成染色剂之外,在生物染色中还使用一些无机化合物,如氯化金、硝酸银、碘、高锰酸钾等。

(二)根据染料的化学反应分类 因为助色团有酸性助色团和碱性助色团之分,故染料也就相应地有酸性染料和碱性染料之别。 1、酸性染料 酸性染料不是指其水溶液一定显酸性。而是指含有酸性助色团与碱作用成盐,其水溶液电离出的有色离子为阴离子染料为酸性染料。

酸性染料是一类色酸盐,含有酸性助色团,常与碱作用生成钠盐、钾盐、钙盐或铵盐,一般溶于水和乙醇。多作为胞浆染色剂。常用的有伊红、酸性品红、苦味酸、刚果红、甲基蓝、水溶性苯胺兰、坚牢绿-FC和橙黄-G等。

2、碱性染料 是一类色碱。含有碱协助色团,其水溶液不一定显碱性,而是与酸能成盐,如与硫酸、盐酸成盐,电离后有色离子为阳离子,这类染料一般能溶于水和乙醇。多作为胞核染色剂。常用的有苏木红(天然染料)、美蓝、中性红、甲基绿、孔雀绿、甲苯胺蓝、尼罗蓝、沙黄等。

四、染色的物理作用和化学作用 染料和被染物结合而着色的过程是相当复杂的。如染料与被染物之间的相互作用,染料与助染剂之间,染料与溶剂之间,被染物与溶剂之间,都存在一定的相互作用和影响。在染色过程中染料与被染物之间既存在物理作用,又存在化学作用,是二者合作用的结果。

(一)物理作用 染色的物理作用包括毛细现象,吸附作用和吸收作用。 1、毛细现象 毛细现象又叫毛细管作用。含有细微缝隙的物体与液体相接触时,液体靠表面张力沿细微缝隙上升或扩散的现象叫毛细现象。

缝隙越细毛细现象越显著。内径小到足够引起毛细现象的管子叫毛细管。组织有许多的微孔,就可借助毛细管作用与染料接触,这是纯粹的物理作用,相当于混合,结合得不牢,不能称为染色,但染色过程它是第一步。

2、吸附作用 吸附是指物质在相界面上浓度自动发生变化的过程,是一种物质从它的周围把另一种物质的分子、原子、离子集中在界面上的过程叫吸附作用。具有吸附作用的物质叫吸附剂,被吸附的物质叫吸附质或吸附物。

吸附作用又分物理吸附和化学吸附。 物理吸附是由于范德华力引起的,作用力弱、吸附为多分子层、无选择性。吸附热小,吸附速度快。化学吸附是由于形成化学键的结果。作用力强,是单分子层吸附、有选择性、吸附热大、吸附速度慢。

在低温下进行的吸附一般都是物理吸附。化学吸附常在较高的温度下进行。 3、吸收作用 吸附质如果进入了吸附剂的内部并均匀地分布在其中,这种现象又称为吸收。

4、分子间的作用力 分子间的作用力是由范德华(Van der walls)第一个提出的,所以把这种力叫范德华力。 (二)化学作用 组织和细胞内化学物质的分子内含有酸性、碱性和两性基团。在一定条件下,被染物质的分子以这些基团与染料分子的助色团发生化学结合而染色。结合方式:离子键,共价键和氢键。

五、细胞的染色 (一)细胞核的染色 细胞核的主要化学成分是核酸和蛋白质。 蛋白质分子中的氨基酸残基含有酸性基团或碱性基团,它可以与染料分子以离子键,氢键或配价键结合。蛋白质的两性电离受环境的pH值影响。

核酸包括DNA和RNA。核酸是由单核苷酸连接成的大分子。在DNA双螺旋结构中,两条核酸链上的磷酸基向外,并电离为负离子使DNA双螺旋的外侧带负电荷。因此容易和带正电荷的碱性染料以及媒染染料以离子键或氢键相结合。

染色体的主要成分为呈酸性的DNA、和RNA,在染色体环境(pH为7.5-7.8),呈酸式电离,带负电,易被电离后带正电荷的碱性染料染色。核质的主要成分为碱性蛋白质,电离后带正电荷,易被负电荷的酸性染料染色。

而核仁具有酸碱两性的性质。 (二)胞浆染色 胞浆的主要化学成分是蛋白质,其次是RNA和脂蛋白质等,多为两性化合物。胞浆的等电点大约在pH4.7-5.0。胞浆的染色与pH值密切相关。当pH值在3.

6-4.7之间,恰好胞核带负电荷为碱性染料染色,胞浆带正电荷为酸性染料染色,使胞核和胞浆区分开来。 (三)胞膜的染色 细胞膜的主要成分为类脂和蛋白质,形成流动镶嵌脂质双层结构。膜的外表面分布有糖脂、磷脂和蛋白质,带负电荷,易被碱性染料染色。

六、媒染染料的染色 (一)媒染染料 有些染料直接对组织染色时,由于染料与组织间的作用力很弱,有时甚至无作用,因此组织着色很浅,甚至不着色。我们必须将这类染料先与媒染剂(如金属离子)结合,生成色淀再对组织进行染色。

凡是能与媒染剂(如金属离子)结合生成色淀的染料称为媒染染料。 常见的媒染染料多半是天然染料,如苏木精,卡红等。 人工合成的煤焦油染料一般不需媒染剂,但有时媒染剂可加强其染色效果,提高染色的坚牢度。

(二)媒染剂 凡能和组织及染料结合,生成色淀,并促进染色的金属离子盐类或金属原子的含氧酸等称为媒染剂。媒染剂既能和染料结合,又能和组织结合,在组织与染料之间起到一个媒介的作用。 常用的媒染剂多为过渡金属元素,一至三价的可溶性盐类或氢氧化物,如铝盐、铁盐、明矾及金属含氧酸等。

(三)促染剂 促染剂是指只增强染料的染色能力,但不参与染色反应的一类物质。如美蓝染液中的氢氧化钾,伊红染液中的冰醋酸、洋红染液中的硼砂、硫堇染液中的石炭酸,金属浸润法中常用的巴比妥及佛罗那等。促染剂的作用是增强染料的染色能力,它与媒染剂的区别在于它不参加染色反应。

七、苏木精-伊红染色方法 苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是细胞与组织学最广泛的染色方法。 一、HE染色的基本原理 (一)细胞核染色的原理 细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸(DNA),DNA的双螺旋结构中,两边链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而被染色。

苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

(二)细胞浆染色的原理 细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.

8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染我以,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。

伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

(三)、二甲苯的作用 烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去,染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同,以便显微镜观察。

(四)、酒精的作用 酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。 伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。

(五)、水洗的作用 在脱蜡经酒精处理之后,水洗切片,是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去,使细胞核染色均匀。 染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。 分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料,中止分化作用。

在伊红染色之后也可以水洗,是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。 (六)分化和蓝化作用 1、分化作用 苏木精染色之后,先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料,这个过程称为染色的分化作用。

2、蓝化作用 分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,在碱性条件下则处于蓝色离子状态,而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用温水或弱碱性水使染上苏木精的细胞核变蓝色,称蓝化作用,以自来水浸洗或温水变蓝为佳。

 苏木素    1 g      无水乙醇    10 ml  蒸馏水 200 ml      钾明矾       20 g                HgO     0.

5 g

先将苏木素溶于无水乙醇中,备用。把明矾放入蒸馏水,加热溶解,再加入备用的苏木素,煮沸 2 分钟,先加入少量的氧化汞,防止氧化过程中苏木素外溢,玻棒搅拌,然后,边搅拌边加入氧化汞。加完后,立即移至冰水中,加速其冷却,静置一夜后,过滤。

用前以 5% 的比例加入冰醋酸。如配好后时间较长,冰醋酸的量可适当多加一点。冰醋酸的量,可直接影响苏木素的着色能力和清晰度。加少了,会造成核浆共染,背景不干净;加多了,核着色能力下降。此液可放置3月至半年左右,视气温而定。使用期要看染色的切片量来定:以每天100张片的量,可使用半个月左右。

(2)Gill改良苏木素液(进行性染色):      苏木精       2  g            无水酒精     250 ml      硫酸铝     17.

6 g            蒸馏水       750 ml      碘酸钠      0.

2 g            冰醋酸       20  ml

    先将苏木精溶于无水酒精,硫酸铝溶于蒸馏水,然后两液混合后加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。此液为半氧化进行性苏木素液,染色不需要分化,不会产生沉淀,氧化膜少。

二、伊红 (1)伊红(水溶性)     配方:     伊红 (水溶性)         2 .

5 -5g        蒸馏水                       500 ml     将水溶性伊红溶于蒸馏水中,然后加浓盐酸10毫升,充分搅拌,静置过夜后过滤。

过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次,再过滤;将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥,加95%酒精1000毫升,配成饱和液。

使用前再用95%的酒精 1:1~2倍稀释,加入1~2%冰醋酸。     此方法具有染色时间快,颜色鲜艳,不容易褪色,使用寿命长等特点。 (2) 伊红(醇溶性)       配方:     伊红 (醇溶性)      2 .

5-5g     95%酒精                  1000 ml    加冰醋酸至半透明状,冰醋酸过多,可导致染浆时细胞核酸化。

三、盐酸酒精分化液: 浓盐酸 0.5~1 ml 75%酒精 99 ml 四、清洗液:    30%盐酸或者用5%苯酚水溶液浸泡24小时,取出后充分水洗。此法可用于盖玻片或载玻片处理。

冰冻切片的注意事项: (1) 速冻:是冰冻切片的关键,因为只有速冻才能减少组织内的冰晶,最好的办法是将速冻头迅速压在组织上,冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织,最好放在液氮里处理。

在液氮里冷冻要注意不要冻过头,2~3秒钟就要拿出来看一下,只要有4/5的组织已经冻住就可以了,待冷冻头拿出后刚好全部冻住,否则就会引起组织发脆,或冷冻头与组织分离。 (2)固定:切片后应立即放入甲醇中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。

固定液有很多种,根据我们的实践,认为甲醇作用快,收缩小,染色较清晰,是冰冻切片最理想的固定液。如加5%冰醋酸较果更好。 (3)包埋剂:可用普通胶水代替,但要加入适量的水(胶水与水的比例大约在2:1左右)。

太稀了,容易损伤切片刀;太稠了,粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。 (4)冰冻用切片刀不仅要磨的快,而且要磨的直,否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。

最好能使用一次性刀片。 (5)如组织发脆,可等几分钟后再切,也可用手在组织上稍稍加温;如果用手去摸组织块,最好戴手套,或用玻片间的纸夹在手与组织之间,以防感染。 (6)冷冻室的温度冬天一般设在-19℃左右,夏天设在-22℃左右。

不同的组织,有不同的温度要求:肝脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右,脂肪组织一般在-35℃以下。 (7) 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态,经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。

二、半导体制冷切片 (1) 组织放置在半导体制冷台上,加少量水,调好切片的厚度 (2) 接通循环流水后,再接通电源,在使用的全过程中不能中断流水,等电源关上后才能停水。并且正负极不能接反,用整流电源控制温度。

冷冻组织周围的水不能过多 (3) 待组织发硬到可切成厚薄一致的切片时,即可切片。切片厚度5~6微米,切片用毛笔展平后,立即放入甲醇中固定,固定时间为1分钟 (4) 苏木素1分钟 (5) 水洗 (6) 盐酸酒精分化1秒钟 (7) 水洗 (8) 温水蓝化 (9) 伊红2~5秒钟 (10) 梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

三、二氧化碳冷冻切片  a) 先将组织放入加热的20%甲醛溶液中固定1~2分钟,水洗(也可将组织不经固定直接放在切片机的冷冻台上) b) 放在切片机的冷冻台上,加少量水,打开二氧化碳开关,此时有二氧化碳气体喷出,待组织出现冷霜后,关闭二氧化碳 c) 切片,切片厚度6~8微米,将切出的片子放于水中舒展,用镊子将组织平铺于载玻片上(如未固定组织的切片直接用载玻片粘贴,立即放入甲醇中固定2秒,然后进行染色,) d) 加热烤片,烤片温度不宜超过60℃,更不能将组织烤焦。

e) 染色时将苏木素滴加在载玻片上,加热1分钟(60℃左右,不能将苏木素烧开,以防切片脱落) f) 水洗 g) 盐酸酒精分化1秒钟 h) 水洗,温水蓝化 i) 伊红2~5秒钟 j) 梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

·           睾丸活检是确诊无精子症后的一项必不可少的重要检查,通过睾丸活检检查可以把无精子症区分为梗阻性无精症、睾丸性性无精子症两类。

睾丸性无精子症是由于各种原因所引起的睾丸生精功通低下所引起的睾丸本身即曲细精管的生精功通低下或缺如所引起,其进一步的检查及治疗需要依据睾丸生精功通的具体情况来确定下一步的诊疗措施,若是睾丸完全失去了生精功能,如唯支持细胞综征,曲细精管纤维化等,就失去了治疗的机会。

就意味着此疾病治疗的结束。在此情况下就需要非常明确的告知患者就目前医疗条件下,即便是医学再发展亦不可能有从根本上治愈的机会,如想要孩子比较现实的做法只有两种选择:1、寻找一家有资质的被国家卫生主管部门批准的人类精子库进行非配偶间人工授精,亦即采用其他男性的精子进行人工受精,所得到的子女与本人没有血缘关系,因此在做此治疗前必需要有充分的心理准备,对此不能有任何的心理阴影。

另一种就是抱养子女。但如果是由于生精功能低下,曲细精管内生精细胞数量减少或阻滞于某一阶段的话,就积极寻找引起生精功通低下所至的原发原因及依据睾丸生精功通损害的程度来评价是否进行进一步的检查及治疗及治疗的预后如何。

若通过睾丸活检检查睾丸曲细精管内各级生精细胞数量基本正常,并能见到成熟精子生成的话,最大可能性为梗阻性无精子症,但由于每一位医生的经历不同,知识结构不同,接诊患者例数不同,所从事的专业不同,对同一位患者的同一病理切片的阅读结果可能有非常大的差异与出入。

这一评价结果却能影响到患者一生的命远。就经历了这样一位患者,在一家省级医院进行了一次睾丸活检检查,睾丸活检检查报告结果出得非常的不专业,对曲细精管的细胞学表现描述得很不到位,只简单的描述为睾丸生精功能低下。

低下到何种程度,具体生精状况如何。使临床医生不所适从,最后我让他到这家医院的病理科把病理切片借阅出来后通过亲自观片,发现为较典型的梗阻性无精子症表现,曲细精管内可见到基本正常数量的成熟精子存在,只是由于病理科病理报告医生对这一特殊的病理标本阅读经验不足而出了以上的报告结果。

并通过详细的病史询问及男性科检查,最后确诊为梗阻性无精子症。形成的具体原因为在其两岁的时候因双侧腹股沟疝进行了一次双侧腹股沟管疝手术。

后通过输精管造影检查明确确寻找到输精管堵塞部位,并通过我们给予双侧输精管吻合术而恢复了输精管的通畅性。术后精液检查精液内有精子存在,半年后其妻喜得妊娠。

为什么会对同一位患的同一病理切片的阅读结果会有如此大的差异呢?原因是在睾丸病理组织病理学上有其自身的特殊性,如:精母细胞体积相对较大,精子细胞体积相对较小,细胞核染色较深,成熟精子在睾丸组织病理切片中所看到的只是精子的头部,而没有尾部,而一般的病理医生大多认为成熟精子是正常形态是由头、体、尾所组成,但成熟精子的病理切片不可能象圆形细胞那样在组织病理切片中会观看到完整的组织细胞结构,而只能观看到精子的头部,因其体尾是病理组织学切片中是无法观察到的。

只能在电镜中才可能观看到精子体尾的片段,一般光镜下是无法观察到的。而这一特殊的病理组织学特征大多数病理科大夫没有认知。

睾丸活检检查结果是确定无精症是否有必要进行进一步的检查及治疗与评价结果预后的一项重要检查。目前由于种种原因,有很多睾丸活检检查的报告不准确,临床医生不能正确阅读睾丸活检片子,造成对虽然做了睾丸活检,但是还不能真正了解睾丸的生精功能状况的情况。因此我们开设了这一睾丸活检病理会诊平台,以期能对无精子症患者的明确诊断提供我们有限的帮助。

睾丸活检是由医生从睾丸中取出少许睾丸组织,送往病理科做病理化验。目前做病理化验多是一些肿瘤性疾病,病理科的医生对肿瘤病理做的非常多,对于此方面的知识也非常的丰富。而无精子症的睾丸活检病理,在临床上都非常少,一般的病理科做睾丸病理远远少于肿瘤病理,对于此方面知识也了解甚少,同时又不能结合患者的双侧睾丸的大小,内分泌等情况做体分析。

所以在发病理报告时不能够如实反应睾丸的生精功能。在我们这儿咨询睾丸活检结果时,看到的报告多是生精功能低下,或生精功能严重低下,生精细胞减少等不确定词语,无法从病理报告中确定睾丸的生精功能,这是病理科医生害怕出现误诊,不做出确切诊断,给自己留了余地。

我们专业治疗无精子症,无精症来我科就诊者较多,十几年来我们做了数千例睾丸活检,对于每一例我们都亲自观看睾丸活检片子,在睾丸活检片子阅读方面总结了大量经验,具体的结果以我们观看睾丸活检片子为准,病理科的报告只供参考。

根据显微镜下观看的睾丸活检片子结果,再结合一些特殊检查和男性科检查,对于每一例无精症来诊的患者都做出了一个非常明确的结论并作为下一步治疗的指导。

无精子症发症率低,大多临床医生对此经验不足,没有病理方面的专业知识,多不亲自观看睾丸活检片子,对于睾丸活检的结果完全以报告为准,又加上病理的报告的不准确性,所以有很多无精子症出现误诊的情况。

我院自从专来开展无精症以来,有病理科固定人员制作睾丸病理片子和发病理报告,我们科里的医生对于每一例睾丸活检片子都亲自在显微镜下观看,并结合患者的睾丸体积和其它检查的结果做综合分析,目前没有一例误诊的情况。

为了减少对睾丸活检阅读的失误,我们现在开展了网上睾丸活检病理分析,你可以把睾丸活检片子邮寄过来,并把其它检查结果和一些重要的体征发过来,我们会给你综合分析并做出确切的诊断。具体病历可按照下面方法填写:

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